蔡强军 陈纪林 张红 丛祥凤

        单核/巨噬细胞可通过细胞表面分子之间的相互作用诱导血管内皮细胞过度表达明胶酶，进而降解基质，削弱纤维帽强度，致使动脉粥样硬化性斑块易于破裂，导致急性心肌梗死等缺血事件。但具体分子途径尚不清楚。
　　最近发现，免疫调节分子细胞分化抗原(CD)40配体(CD40L)及其受体CD40这一对免疫系统细胞间信息传递的主要介质广泛分布于不稳定斑块中的巨噬细胞和内皮细胞，其数量和分布与内皮细胞明胶酶的表达具有共消长的关系，提示CD40与CD40L相互作用可能是巨噬细胞上调节皮细胞明胶酶活性的关键机制。
本研究采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与人巨噬细胞膜共孵育的方法，探讨巨噬细胞CD40L对内皮细胞明胶酶A(MMP2)和B(MMP9)及其天然组织抑制物(TIMP1和TIMP2)活性和蛋白表达的影响。
1．材料和方法
　　内皮细胞培养与鉴定 于2000年8月在我院分离健康新生儿HUVEC，于M199培养基中进行培养，第3代细胞为实验所用。鉴定根据第Ⅷ因子抗原免疫组化染色阳性。
　　巨噬细胞的衍化及其膜制备 以淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离健康人外周血单核细胞，于RPMI 1640培养基中贴壁培养10天，使其衍化为巨噬细胞。鉴定依据为CD68抗原免疫组化染色阳性。无菌条件下以蔗糖密度梯度离心法制备巨噬细胞膜，调整浓度至相当于107细胞/ml，4℃贮存备用。
　　CD40和CD40L信使核糖核酸(mRNA)的检测提取细胞总核糖核酸(RNA)，以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮细胞CD40和单核/巨噬细胞CD40mRNAR 的表达。引物序列如下：①CD40：上游5’CCTCGCCATGGTTCGTCTGCC3’，下游5’ AGCCAGGAAGATCGTCGGGA3’；②CD40L：上游5’ CCTCAAATTGCGGCACATGT3’，下游5’ GACAAACACCGAAGCACCTGG3’；③3-磷酸甘油醛脱氢酶：上游5’ CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA 3’，下游5’ TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC3’。多聚酶链反应(PCR)扩增产物分别为740、360和598bp，以1.8%琼脂糖凝胶电泳，经紫外成像仪成像。
　　实验分组 待第3代内皮细胞生长至80％~90％融合时将培养液换为无血清的M199培养基，继续培养24小时。一组按细胞数1:1的比例加入巨噬细胞膜；另两组则加入预先与小鼠抗人CD40L单克隆抗 体或小鼠对照免疫球蛋白(Ig)G(浓度均为1μg/ml)孵育1小时的巨噬细胞膜；以50ng/ml(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)刺激内皮细胞为阳性对照组。
　　明胶酶谱法则定明胶酶活性 收集HUVEC培养液，以Lowry法测定蛋白浓度。将30μg蛋白在4℃、以含 有1mg/ml明胶的10％十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。2.5％ Triton-X100溶液漂洗30分×2次，继之以Triton-X100漂洗缓冲液(2.5％ Triton-X100,50 mmol/L Tris, PH7.6)漂洗15分×2次，然后于反应液(0.05% Brij35, 0.2 mol/L NaCl,50 mmol/L Tris, 10 mmol/l CaCl2, 1μmol/L ZnCl2, PH7.6)中孵育48小时(37℃)。室温下以0.25％考马斯亮蓝R250染色，经脱色至蓝色背景中显示清晰透明条带时将凝胶干燥、照相，行光密度分析。
　　TIMP活性测定 U937细胞条件培养液制备：将密度为106/ml的U937单核细胞株于无血清RPMI 1640培养基(含 50ng/ml PMA)中孵育24小时，收集培养液。以明胶酶谱法证实其确实具有明胶酶活性。逆明胶酶谱法：将含30μg蛋白的HUVEC培养液以含有1mg/ml明胶的10％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺胶与U937培养液比例为13:2)电泳分离，经漂洗、孵育、染色、脱色等步骤，可见无色背景下清晰的蓝色条带，行光密度分析。
Western印迹 提取HUVEC蛋白，将30μg蛋白经10％SDS-PAGE电泳分离后以半干电转法转移至硝酸纤维素膜。室温下用封闭液(1％牛血清白蛋白，1‰Tween-20磷酸缓冲液洗膜30分后再与1:100 000辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗小鼠)室温下孵育1小时，洗膜后与超强信号化学发光试剂(美国Pierce公司)反应5分，暗盒中压片1~5分，经显影、定影后以激光光密度仪(美国Bio-Rad公司)分析灰度。
　　统计学处理 实验数据以均数±标准差表示，均数差别显著性用t检验。P＜0.05为差异有显意义。
2．结果
　　2.1 CD40和CD40L的表达：正常HUVEC和新鲜提取的人外周血单细胞分别表达CD40和CD40L mRNA。当单核细胞衍化为巨噬细胞后CD40L表达显著增强。
　　2.2 明胶酶活性和蛋白表达的变化：正常HUVEC具有微弱的MMP9明胶酶活性和活化型MMP2明胶酶活性，与巨噬细胞膜共孵育18小时后二者活性分别增强2.38和3.40倍(P＜0.01)；阻断CD40L的作用可抑制此效应分别达60.1％和53.6%(P＜0.01)，均有非常显著性差异，而对照抗体无显著影响。同时，酶原型MMP2/酶原型MMP2酶活性之比在正常HUVEC为0.25，与巨噬细胞膜共孵育后升至0.47(P＜0.01)，阻断CD40L的作用后降至0.37(P＜0.01)，均有非常显著性差异。Western印迹结果显示，细胞内明胶酶蛋白表达与培养液酶活性的变化是一致的。(图1)
图1 巨噬细胞膜和抗细胞分化抗原40配体(CD40L)抗体对人脐静脉内皮细胞明胶酶活性和蛋白表达的影响 a：酶谱法检测明胶酶活性 b、c：Western印迹法测明胶酶蛋白表达 1：阴性对照 2：巨噬细胞膜 3：对照免疫球蛋白G 4：抗CD40L抗体 5：(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐阳性对照MMP-2、MMP-9分别为内皮细胞明胶酶A和B。
　　2.3 TIMP活性和蛋白表达的变化：TIMP1和TIMP2活性和蛋白表达不受巨噬细胞膜或抗CD40L抗体的明显影响。
3．讨论
　　纤维帽的厚度是决定动脉粥样硬化性斑块稳定性的重要因素。明胶酶(MMP9和活化的MMP2)通过降解IV型胶原和部分变性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原等细胞外基质从而削弱纤维帽的机械强度；而组织基质金属蛋白酶抑制物TIMP1和TIMP2可抑制明胶酶活性，这二者之间的平衡是决定纤维厚度的关键因素。
　　内皮细胞过度表达MMP2和MMP9是不稳定斑块的主要特征之一，而内皮细胞明胶酶的过度表达与内膜巨噬细胞浸润的程度和范围高度一致，提示二者可能存在某种因果关系。细胞共培养研究证实，单核/巨噬细胞可通过直接的相互接触增强内皮细胞明胶酶的表达，但具体通过何种分子机制尚不清楚。
最近发现，免疫调节分子CD40L及其受体CD40均强烈表达于斑块内巨噬细胞与内皮细胞，并且其分布与内皮明胶酶的表达呈共消长的关系，而正常动脉内膜没有这两类分子的表达，提示巨噬细胞通过CD40与CD40L相互作用与信号传递可能是上调内皮细胞明胶酶表达的关键机制。
　　本研究发现，巨噬细胞膜可使内皮细胞在正常情况下极弱的MMP9和活化型MMP2酶活性显著增强，而酶原型MMP2酶活性基本不受影响，导致活化型MMP2/酶原型MMP2酶活性之比显著增加。抗体阻滞试验表明CD40与CD40L相互作用是导致内皮细胞明胶酶活性升高的最主要因素。Western印迹结果说明，明胶酶活性的增强是蛋白分子合成增加的结果，研究显示，活化型MMP2比例较高，而MMP9只有酶原形式。这可能是因为MMP9在体内主要靠纤溶酶等激活，这与细胞培养的条件有较大差异；相反，MMP2则主要通过内皮细胞表面的膜型MMP(MT1-MMP)激活，后者呈固有性表达，并可能被巨噬细胞进一步诱导。
　　明胶酶活性在体内受其生理性抑制物TIMP的抑制，其中TIMP1对两种明胶酶均有抑制作用，而TIMP2主要抑制MMP2。本研究发现，巨噬细胞通过CD40与CD40L相互作用在增强内皮细胞明胶酶表达的同时，对TIMP1和TIMP2活性和蛋白表达均无明显影响，从而破坏了二者的平衡，增强基质降解活性。
　　本研究还发现，单核细胞衍化为巨噬细胞后CD40L表达明显增强，说明浸润于斑块中的巨噬细胞较之循环单核细胞在增强斑块易损性方面更具有病理意义。阻断CD40与CD40L相互作用是否能成为防治动脉粥样梗化斑真破裂的一个新环节尚有待深入研究。