南方医科大学南方医院 心内科 吴平生，刘城，陶宇

    目前，冠状动脉疾病（coronary artery disease，CAD）和外周动脉疾病（peripheral arterial disease，PAD）的治疗在药物、经皮介入及外科手术方面均取得了重大进展，但仍然有一部分患者需要探索新的治疗手段或者治疗策略。

    自Folkman等^[1]首次证实促血管生长因子以来，治疗性血管新生即成为缺血性疾病治疗策略的一部分，并将导致急、慢性缺血性疾病的治疗模式的转变。

    血管新生是指新血管形成的这一生物学过程。广义的血管新生涉及血管发生、血管新生以及动脉生成这三个主要的过程。血管发生是指胚胎发育过程中血管从无到有的过程；血管新生是指从已存在的微血管床上芽生出新的毛细血管；动脉生成是指在已经生成的小动脉基础上形成管径更大的侧支循环。

    治疗性血管新生主要分基因治疗和细胞治疗。其中基因治疗又主要分为血管新生基因重组蛋白治疗和载体介导的基因治疗两大类。已用于治疗性血管新生的基因有血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）、内皮细胞发育调节基因（developmentally regulated endothelial locus 1，Del-1）以及肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）等。

    1　临床试验

    1.1　VEGF

    1.1.1　VEGF用于治疗外周动脉疾病　首个通过腺病毒介导的转基因治疗PAD的随机、双盲、安慰剂对照试验（RAVE试验）发现，主要和次要终点指标在各组间无显著性差异，但是，接受AdVEGF121治疗组中有剂量依赖的外周水肿^[2] ，因为VEGF的效应之一就是增加血管通透性，所以这是给予AdVEGF121后具有生物活性的证据。

    1.1.2　VEGF用于治疗缺血性冠状动脉疾病　Euroinject One试验是一项在有症状但不适宜行外科血运重建术CAD患者中给予裸pVEGF165治疗的随机、双盲、安慰剂对照试验。3个月后，心肌压力灌注缺损以及加拿大心血管病学会（Canadian Cardiovascular Society，CCS）心绞痛分级在各处理组间并无差异，但是，VEGF165治疗组在局部室壁运动分数（由EMM测定）以及左心功能方面则明显改善^[3] 。

    1.2　FGF　FGF1和FGF4用于人心血管疾病基因治疗试验研究。

    1.2.1　FGF1　临床试验TALISMAN 201的结果显示，经肌肉内注射NV1FGF治疗性血管新生改善严重肢体缺血（critical limb ischemia，CLI）患者非截肢存活率。治疗25W后，治疗组（19.6%）与安慰剂组（14.3%）在溃疡愈合（主要有效终点）患者的比例上无显著差异。然而，治疗组的截肢率 （37.3%）明显低于安慰剂（55.4%）组（HR=0.498，P=0.015），且治疗组的死亡率要低^[4] 。

    1.2.2　FGF4　FGF4基因（Ad5FGF4）治疗的效果在AGENT 试验中得到了评估。虽然在主要有效终点上各组间无显著差异，然而，post hoc 分析表明Ad5FGF4能明显改善女性患者、65岁以上具有3-4级心绞痛患者的踏车运动试验（exercise treadmill test，ETT）时间^[5] 。有理由认为，Ad5FGF4对因微血管功能不全引起的心绞痛较因狭窄引起的心绞痛有效的多。

    1.3　肝细胞生长因子　HGFSTAT试验中研究者将104例CLI患者随机分配到安慰剂或低、中、高3个HGF剂量组。60%的患者出现了严重的不良反应，研究认为HGF基因治疗是非安全的^[6] 。

    1.4　缺氧诱导因子-1α　转录因子HIF-1α参与下游多个下游靶基因的表达，参与病理、生理的血管新生，被认为是一种“总开关”效应。因此，以HIF-1α或其它氧传感细胞元件为靶点的缺血性疾病的治疗正在深入研究。Rajagopalan等^[7]在38例PAD和CLI患者中进行了一项I临床试验——剂量确定试验，以期获得改良的具有成组活性的HIF-1α的安全性，当腺病毒介导以肌肉内注射的方式给予。该试验中未观察到不良反应，能减轻疼痛，促进溃疡愈合，虽然小样本研究无法评估其有效性。

    目前已经完成的一项入组了289例重症间歇性跛行患者的随机对照试验（WALK）的初步结果在2009年3月已经发表，显示各组在ETT时间上（主要研究终点）无显著差异^[8] 。

    1.5　内皮细胞发育调节基因- 1（Del-1）　Del-1基因治疗PAD的效果在Ⅱa期临床试验（DELTA）中的评价显示，治疗90天后，各组在pETT（主要有效终点）以及其它几个次要有效终点上无显著差异^[9] 。

    2　经验教训

    自人类第一例血管新生基因治疗的试验报道至今已有15年。尽管有充分的临床前研究表明转基因的生物活性，一些早期的临床试验也已证实基因治疗是安全、可行、有效的，随机对照临床试验在是否有效方面并不具有确凿证据。

    2.1　临床前试验模型的局限性　动物模型之间以及临床试验入组患者之间的差异不能忽视。临床前研究所使用的动物均是青年、健康的，然而患者通常是老年的且伴发多种合并症。临床和流行病学研究表明年龄是不良结局的一个强有力的预测指标；同样地，患有血管缺血损伤的老龄动物也不太可能完全的康复。构建更多的临床预测模型（例如，老年的、动脉粥样硬化的、糖尿病动物模型）。尽管这些模型不能完全的模拟人类疾病，但他们能为验证治疗的潜能提供更严谨的测试。

    2.2　治疗的剂量和疗程　促血管新生基因治疗的最佳剂量、疗程以及时机仍没有定论。非缺血动物模型的临床前数据表明，形成成熟的毛细血管需要数周乃至数月的时间，不再需要生长因子的刺激，但在缺血模型中是否需要延长促血管新生刺激的时间目前尚不清楚。质粒DNA的表达仅在给药后的数天，腺病毒基因表达通常需要数周；因此，一个（或几个）剂量治疗终末期缺血性疾病的临床研究可能因疗程不够而疗效不明显。

    2.3　转基因途径和载体的选择　冠状动脉内及外周给予不能将足量的载体传递到靶位置。均因内皮细胞对载体的通透性差引起，局部肌肉注射似乎是更为有效的手段。有一些新技术，如超声耦合的脂质微泡，冠状静脉窦逆行灌注等正在被用于临床前研究。

    理想的载体将具有低免疫原性、高转染效率、安全性以及在特定时间内转基因表达。

    最常使用的载体是质粒DNA和腺病毒载体。

    质粒DNA因为在转基因剂量下不整合到宿主DNA中去，但裸DNA的生物活性低下则限制了其应用。

    腺病毒载体高转导效率以及较长时间的基因表达，但是能引起免疫反应，如果患者因上呼吸道感染产生相关抗体之后则无效。

    腺相关病毒载体具有很多血清型，只有少数几个血清型具有低免疫反应的特点，维持基因表达，并对心脏显示出某种程度的选择性。虽然腺相关病毒载体能携带大分子的基因且不整合到宿主体内等优点，但实验结果发现其介导的基因表达水平以及表达时间低于预期。

    慢病毒载体能整合到宿主基因组中而发生恶性转变。

    2.4　终点的选择　缺乏足量的患者，难于用死亡率或保全患肢等指标衡量疗效。需寻找其他指标和替代终点。

    基因治疗可能改善亚段的微循环功能而不与血管分布相一致。单光子发射计算机断层成像术（single-photon emission computed tomography，SPECT）测量心肌不同部位的相对血流情况，然而，采用正电子发射断层成像术（positron emission tomography，PET）或者心脏磁共振灌注成像（cardiac magnetic resonance perfusion imaging，CMR-PI）评价绝对血流可能更为合适。今后有关治疗性血管新生的临床前和临床试验必须使用PET或CMR-PI。

    2.5　患者人群　几乎所有的心血管疾病的基因治疗临床试验均把“终末期”或“非选择性”的患者，在无其他更好的治疗选择的前提下，新的治疗手段的实施风险对他们来讲是可接受的，能从中获得最大的收益。

    然而，重症心血管疾病患者由于忍受了数十年的全身性损害，所以单一剂量或短疗程无法使其获益，即使该治疗是有疗效的。

    此外，终末期疾病一般是进展性的，局部治疗的改善可能被其他部位病情的进一步恶化或其他伴发疾病的进展所抵消。
为了进一步证明心血管基因治疗的安全性，有必要选择较健康的患者进行试验。

    2.6　安全性　近10年来，已有1000多例患者被选入有关血管新生基因治疗的安慰剂对照试验，迄今尚未发现重大不良安全事件。肿瘤、视网膜病以及其他疾病，研究者要密切关注病理性血管新生的体征。

    3　未来方向

    新生血管的起源、发展以及维护是一个复杂的、相互作用的过程，涉及血管新生、血管再生以及动脉生成。

    多血管新生因子联合，或能激活多血管新生途径的单一因子（HIF-1α）可能是未来研究的主要方向。

    细胞治疗和血管生成因子的组合，以及使用生物材料加强微环境是缺血性组织修复的另一个富有希望的战略。

    参考文献
    [1]   Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications[J]. N Engl J Med, 1971, 285(21)：1182-1186.
    [2]   Rajagopalan S, Mohler ER 3rd, Lederman RJ, et al. Regional angiogenesis with vascular endothelial growth factor in peripheral arterial disease： a phase Ⅱ randomized, double-blind, controlled study of adenoviral delivery of vascular endothelial growth factor 121 in patients with disabling intermittent claudication[J]. Circulation, 2003, 108(16)：1933-1938.
    [3]   Kastrup J, J?rgensen E, Rück A, et al. Direct intramyocardial plasmid vascular endothelial growth factor-A165 gene therapy in patients with stable severe angina pectoris A randomized double-blind placebo-controlled study： the Euroinject One trial[J]. J Am Coll Cardiol, 2005, 45(7)：982-988.
    [4]   Nikol S, Baumgartner I, Van Belle E, et a1. Therapeutic angiogenesis with intramuscular NV1FGF improves amputation-free survival in patients with critical limb ischemia[J]. Mol Ther, 2008, 16(5)：972-978.
    [5]   Henry TD, Grines CL, Watkins MW, et al. Effects of Ad5FGF-4 in patients with angina： an analysis of pooled data from the AGENT-3 and AGENT-4 trials[J]. J Am Coll Cardiol, 2007, 50(11)：1038-1046.
    [6]   Powell RJ, Simons M, Mendelsohn FO, et al. Results of a double-blind, placebo-controlled study to assess the safety of intramuscular injection of hepatocyte growth factor plasmid to improve limb perfusion in patients with critical limb ischemia[J]. Circulation, 2008, 118(1)：58-65.
    [7]   Rajagopalan S, Olin J, Deitcher S, et al. Use of a constitutively active hypoxia-inducible factor-1alpha transgene as a therapeutic strategy in no-option critical limb ischemia patients： phase I dose-escalation experience[J]. Circulation, 2007, 115(10)：1234-1243.
    [8]   Creager MA, Olin JW, Belch J, et a1. A randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel group study of ad2/hypoxia inducible factor (HIF-1a/vp16) in patients with intermittent claudication[R]. The American College of Cardiology Annual Scientific Sessions, 2009.
    [9]   Grossman PM, Mendelsohn F, Henry TD, et al. Results from a phase Ⅱ multicenter, double-blind placebo-controlled study of Del-1 (VLTS-589) for intermittent claudication in subjects with peripheral arterial disease[J]. Am Heart J, 2007, 153(5)：874-880.

    文章来源：中国医学前沿网