北京友谊医院    王雷    赵林

　　干细胞具有多向分化产生不同组织细胞的能力，在一定的条件下可以诱导分化为心肌细胞，这使其在心血管病的治疗中引起了广泛重视。本文将对目前常用及有潜力应用于临床研究的干细胞种类、研究机制和存在的问题进行详细的探讨。

　　一、干细胞移植细胞类型

　　胚胎心肌细胞

　　胚胎心肌细胞是最早应用于治疗心血管病的供体细胞。Soonpaa等1994年首先报道将小鼠胚胎心肌细胞移植到正常小鼠心脏中，发现移植的细胞能够成功存活分化，并在电镜下观察到移植细胞与邻近的宿主心肌细胞形成闰盘连接，初步证实了心肌细胞移植的可行性。随后，Li等在大鼠心肌冷冻坏死模型上移植大鼠胚胎心肌细胞，术后4周，移植的胚胎心肌细胞发生同样分化现象。但是，由于胚胎心肌细胞对缺血特别敏感，在体外不易扩增，胚胎心肌细胞不易获得以及伦理学上存在争议等因素，限制了胚胎心肌细胞的应用。

　　胚胎干细胞

　　胚胎干细胞来源于种植前胚胎的细胞，具有以下特性：(1)来源于多能干细胞群；(2) 在体外仍保持稳定的二倍体；(3)永生的，并能够在原始胚胎状态下无限繁殖；(4)在移植或体外适当培养条件下能够自发分化为内、中、外三个胚层的多种类型细胞，包括生殖细胞。胚胎干细胞可在体外生长，并能在原始未分化状态无限繁殖，且仍具有多能性，核型保持正常。这些特性使人胚胎干细胞的研究和应用具有广阔的前景。

　　要使上述设想变为现实，很多技术难题有待解决，这些问题包括：(1)胚胎干细胞极易分化为其他细胞，如何维持体外扩增时不分化？(2)如何定向诱导干细胞分化？(3)胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官这一目标还需要技术上的突破。(4)如何克服伦理学纠纷和供体来源受限等缺点。(5)如何克服移植排斥反应？核转移技术可以解决这一问题，但随之引起的其他一系列遗传不稳定性问题还需进一步研究。(6)胚胎干细胞移植的长期安全性和有效性仍需观察。

　　成体干细胞

　　与胚胎干细胞相比，骨髓干细胞、骨骼肌干细胞和外周血干细胞容易从自体采集，避免了胚胎干细胞移植所面临的伦理学问题；自体干细胞移植不存在免疫排斥反应，适合临床应用，成为近几年干细胞移植临床实验研究的主要细胞来源。

　　成人干细胞移植在动物实验和临床研究方面，显示了其安全性和有效性结果，是目前研究的热点和焦点。但是在实验和临床应用研究中也发现了成人干细胞移植的不足之处：1.骨髓干细胞起源的骨髓单个核细胞、骨髓间充质细胞、AC133+细胞和内皮祖细胞虽能改善心功能、促进血管再生，但只有骨髓间充质细胞可以分化为心肌细胞；2.骨髓干细胞起源的细胞数量有限，并随着年龄的增长而减少，须经体外扩增到足够的细胞数量，并且培养过程中很可能发生分化、衰老；3.成人骨髓干细胞分化能力低、促血管生成能力弱、受到环境的影响多（如EBV、日光等），所携带异常基因增多；4.取材具有有创性，不易为患者接受，且取材和分离受时间限制，不能应用于急诊治疗。5.目前临床试验应用的细胞移植改善梗死心脏功能的疗效并不理想，并且不相一致。BM-MNCs引起LVEF升高在5%左右，EPCs移植使LVEF增加不到10%，移植MSCs使LVEF上升也不过20%，而AC133+细胞移植虽然改善患者生活质量和梗死心肌灌注，但不明显提高局部收缩功能。

　　脐血干细胞

　　与骨髓干细胞相比，脐血干细胞是从脐血中分离出来的一类干细胞，具有如下优势(1)含有多种分化能力的干细胞，具有多向分化潜能，既可分化为心肌细胞，也可产生新生血管、内皮细胞等；(2干细胞含量丰富、无需体外扩增；(3)较骨髓起源的干细胞，具有更强的增殖分化潜能；(4)受环境影响少，携带异常基因更少；(5)取材方便，不会给供体产生伤害。这些独有的特点越来越受到临床关注，因此也逐渐开展了关于脐血干细胞治疗心肌梗死的研究。

　　二、干细胞移植治疗机制

　　干细胞移植可能机制包括：1. 分泌促血管生成因子促进心肌血管网络重建；2. 分化生成新生的心肌细胞并担负一定的舒缩功能；3. 通过旁分泌途径促进心脏侧支循环的建立和有效的血液灌注；4. 抑制心肌细胞凋亡。但究竟是哪一种或哪几种机制在起作用，作用程度如何，至今尚未明确。

　　三、干细胞移植存在的问题

　　干细胞移植为心血管病治疗带来新的希望，但目前将其大规模地作为心血管病的常规治疗尚有大量问题需要解决。

　　干细胞移植安全性

　　以往对于干细胞移植的争论主要集中在胚胎干细胞和骨骼肌成肌细胞方面，但随着研究的深入，骨髓干细胞也不像人们想象的那样安全可靠，除Kang等的MAGIC研究发现G-CSF动员有加重支架内再狭窄风险外，BM-MNCs、MSCs移植均存在风险。Vulliet等研究发现，冠脉内移植MSCs会引起冠状动脉微梗死。Yoon等发现，MSCs有形成肿瘤之虞。Rubio等研究发现，MSCs在体外经长期培养可自发形成肿瘤样细胞。Zhang等研究结果显示，移植干细胞源性心肌细胞，可因这些细胞迁移到正常心肌中，会加重梗死周边心肌细胞缺血，加重心肌细胞死亡。其他干细胞如胚胎干细胞、脐血干细胞尚未应用于临床，但体外培养和动物研究也发现相同的问题，同时脐血干细胞应用于动物实验中，同时存在免疫原性问题。由此可见，对于干细胞移植治疗心肌梗死的安全性和疗效评价，必须开展多中心、大规模、随机对照研究，随访后才能得出确切结论。

　　干细胞移植时间窗

　　宿主心肌内环境与干细胞的生存状况密切相关，何时进行细胞移植尚无定论。目前有关移植时间窗的研究较少。Strauer认为，经冠脉内移植最好是在AMI后7～14天进行，因为AMI后5天内心脏剧烈的炎症反应会导致干细胞无法存活，而在AMI两周后进行移植则会降低疗效。但也有研究报道，AMI两周后是最佳的移植时间。在BOOST试验中，移植时间选择在首次发生ST段抬高AMI后5天之内。而Silva等在冠状动脉前降支狭窄30天后将MSCs植入心脏，再过30天后进行组织学研究检测到MSCs分化形成平滑肌细胞和内皮细胞，血管密度增加，心功能改善。如果确定最佳的移植时间窗，必须进行多个时间点的比较研究才能得出结论。

　　干细胞移植方法学

　　干细胞移植途径通常为经冠脉内、经心内膜、经心外膜和经静脉注射。Strauer等首先提出了冠脉内移植治疗可安全应用于临床，随后的BOOST研究更进一步证明AMI患者可以较好地耐受这种移植方法。国内葛均波教授等的研究发现，心肌梗死早期骨髓干细胞移植有利于梗死心脏功能恢复，大部分移植的细胞能归巢到梗死心脏。但是，这种方法也有不足，首先，对于体积较大的细胞而言，如MSCs、成肌细胞等，可导致微血栓形成；其次，在移植时如何保证尽可能多的干细胞穿越血管壁分布到心肌组织中？Suzuki等提出通过增加冠脉内压力可增强移植效果。目前临床报道中，普遍采用球囊充气膨胀暂时阻断冠脉内血流的方法促进干细胞进入梗死区域，是否真正有效还有待研究。Hagege等尝试经静脉冠状窦移植骨骼肌干细胞治疗心肌梗死的研究发现，这种移植方式也能有效改善梗死心脏功能，是一种创伤性小的细胞移植方式。由此可见，细胞移植途径的选择应从怎样才能让患者获益最大方面考虑，经冠状动脉内移植和心内膜下移植或心外膜移植与心脏介入治疗或冠状动脉旁路移植术联合应用不仅能改善心肌血供，也能通过再生心肌细胞代替瘢痕组织，更有利于改善心室功能。静脉移植途径与内科传统药物治疗联合应用，也为一种有效的治疗方法。

　　干细胞移植评价方法

　　由于受到方法学限制，在临床研究中不能随意进行心脏组织学检测，干细胞在人体心脏内的分化、增殖情况还不得而知，所以细胞移植的疗效只能采用检查心功能和（或）心肌灌注的方法来评价。心脏超声检查简便无创，重复性好，

在干细胞移植中经常被采用。超声检查项目多样，除基本的M型和二维超声外，近年来发展的TDI、3-D、Strain、Strain Rate等显像技术在心肌运动方面准确性提高，而药物负荷试验、心肌声学造影等手段还能够对心肌存活、灌注等情况作出综合评价。心脏MRI检查具有优良的时间和空间分辨率，可以动态观察心脏的室壁运动情况，测量心肌的厚度以及增厚率，测量心脏的容积和血液进出流量，可由心脏体积、室壁厚度等方面评判细胞移植疗效。PET技术在存活心肌检测方面具有较大优势，灵敏度高，缺点是需要使用放射性核素，而且检查费用昂贵，难以推广使用。

　　干细胞移植标记方法

　　在体示踪植入人体的干细胞，能够获得有关细胞归巢、分布、定植等重要信息，有利于尽早阐明干细胞移植改善心脏功能的机制问题。CT技术目前虽已广泛用于临床，但其应用于活体示踪细胞时由于仅能用高密度造影剂而无法实现；生物发光和荧光标记技术已经在动物实验中应用，却无法应用于临床；SPECT和PET技术，该技术可用于干细胞示踪，但是所使用的放射性标记物可能引起基因突变；MRI是目前最常用的干细胞示踪技术，影像的三维重建效果好，但是患者带有ICD或Pacemaker会影响图像采集，并且不能准确评价存活细胞。由此可见，目前尚无任何一种标记和显像技术可以完美地应用于临床干细胞移植中的在体示踪。

　　综上所述，干细胞移植机制的研究和规范化临床试验的开展均需亟待突破。各种干细胞移植疗效的判定、安全性的评价、移植方法的选择、细胞移植时间确定、疗效评价技术寻找和不同干细胞疗效对比等问题并未完全解决。随着干细胞基础与临床研究的进展，干细胞移植将具有广阔的前景。