文/徐标 顾蓉      南京大学附属鼓楼医院

徐标  南京大学医学院附属鼓楼医院；心脏科主任，医学博士和临床药理学博士后，主任医师，教授，博士研究生生导师。1997年起先后4次作为博士后和博士后高级访问学者赴英国King’s College的St Thomas医院和Guy医院工作学习。享受国家政府特殊津贴，中华医学会江苏省心血管分会副主任委员，南京心血管学会主任委员，中华医学会南京电生理学会名誉主任委员，Circulation，Circulation Research, J hypertension, ATVB等SCI期刊的特约审稿人，兼任《中华高血压杂志》、《中国动脉硬化杂志》、《中华现代内科学杂志》等编委。先后主持国家自然科学基金项目研究5项，省级科研项目20余项。发表论文150余篇，SCI收录39篇，其中两篇发表在《Circulation》杂志上，影响因子达14.496。

人类左心室包含了大约20亿-40亿个心肌细胞，而一次心肌梗死在几小时内就可以丢失掉25%左右的心肌细胞。高血压或心脏瓣膜病等心脏容量或压力超负荷状态也可以导致心肌细胞凋亡而使有功能的心肌细胞逐渐减少。在没有心脏病的情况下，随着人体的衰老，大约每年会丢失1g的心肌组织（约2000万个心肌细胞）。而各种心脏疾病发展的终末阶段——心力衰竭也是以心肌细胞的丢失、残留心肌细胞的功能恶化为主要特征。因此促进心肌细胞的再生, 恢复有功能的心肌细胞数量,从根本上修复损伤的心肌组织就成为亟待发展的治疗策略。本文将总结动物和人体中心肌细胞再生的证据，目前心脏干细胞移植在心脏再生中的地位及存在问题、最近研究发现的microRNA对于心肌修复的影响以及胞外基质对于心脏再生的影响，并对心肌修复的未来进行展望。

两栖类和鱼类有心肌再生的能力

许多两栖类和鱼类在损伤后可以再生肢体以及一些内脏器官。通过手术将斑马鱼的心室切除20%，在两月内切除的心肌能完全再生。在生理状态下，斑马鱼的心肌细胞比等量的哺乳动物心肌细胞具有更高的细胞循环活性。研究显示，斑马鱼的心肌再生主要是由先前已存在的心肌细胞增殖而来，而不是干细胞介导的心肌细胞再生。

哺乳动物心脏有有限的再生能力

有趣的是，最近的研究发现人类以及其他哺乳动物的心脏在正常衰老及疾病过程中同样具有一定程度的再生能力，而与斑马鱼不同的是，哺乳动物心肌梗死后的心脏再生更多的依赖于干细胞的分化而非心肌细胞的增殖。这种差异在心脏发育的早期似乎并不存在。如Porello等报道了将出生一天的小鼠左室心尖部切除（约为左室心肌质量的15%），小鼠不但存活而且切除的心肌在三周左右可以再生，心功能得到改善。而这种再生与斑马鱼类似，都是通过先前已存在的心肌细胞的增殖获得。这种再生能力在生后7天的小鼠中就消失了，可能是因为双核心肌细胞的丢失以及细胞循环活性的减少。

人类心脏再生的证据

传统观念认为人类心脏是终末不分化器官，不具有再生潜能。而最近的研究使人们再次审视了这一观点。形态学分析显示正常人体心肌细胞在生后两月有大约20亿个心肌细胞核。在生理性肥厚情况下，心肌细胞核的数目相对稳定。然而当心脏质量超过450g时（正常心脏质量约210g），细胞核的数目与心脏质量呈线性正相关。因为人类心脏在肥厚过程中其细胞核的数目并无改变，所以这提供了心肌细胞再生的证据。非心肌细胞的核数目也与心脏质量呈线性相关，提示这些细胞的增殖也伴随了心脏生长的整个过程。但是细胞核数量的增加并不意味胞质分裂的存在,可能是多核细胞数量的增多。

有两个研究更为直接地证实人类心肌细胞的更新潜能。Frisen等利用冷战时期核爆炸产生的大气中的¹⁴C整合到植物中被人类通过食物链摄取，而¹⁴C结合分裂细胞DNA的原理证实了成人心肌具有自我更新潜能。并证实了这种更新是年龄依赖性的，在20岁时约有1%的心肌细胞更新，而在75岁时这一比例仅为0.45%。通过这些数据，我们可以预测在正常人的一生中约有45%的心肌细胞得以更新，而55%的细胞从出生起即保持不变。另一项由Kajstura等人对用胸腺嘧啶脱氧核苷类似物（IdU）治疗的肿瘤病人进行心脏解剖来研究DNA合成速率。IdU可以整合到新生的DNA中，并使细胞对放射治疗敏感。研究者发现这类病人的心肌细胞DNA合成显著增多。总之，这些研究都提供了强大的证据证实人类成体心脏核分裂的存在和可能的心肌细胞数目增殖，但是这是一个非常有限而缓慢的过程，并不足以在心肌梗死或心脏受到其它损伤修复心脏使心脏功能恢复正常。所以，我们需要进一步地研究来调控这一过程，以期获得最大的治疗作用。

干细胞和细胞治疗

干细胞治疗的研究早在2000年初就已广泛开展以期治疗心脏病。从动物实验中得到的证据表明损伤的心脏功能可以通过扩增具有自我增殖和分化潜能的干细胞诱导组织再生得以恢复。现就心脏再生的干细胞来源及目前各类干细胞在心脏再生中所处的地位及存在问题简述如下:

一、心脏再生的干细胞来源

1、胚胎干细胞（ESC）

ESC来源于胚囊的内细胞团，Xue等的动物实验证实ESC可以分化为心脏细胞并整合到受体的心脏组织中，可和本身的心肌细胞形成有效的电-机械偶联。ESC移植治疗心肌梗死可以再生缺血区域的心肌、改善左室功能。但是真正分化为心肌细胞并具有良好的收缩能力的细胞数量有限。另外，ESC分化到心肌细胞的机制也没有完全地阐明，并存在伦理方面的问题。ESC还可能会引起畸胎瘤和免疫排斥反应。鉴于以上原因，目前还没有开展用ESC治疗心脏病人的临床研究。

2、诱导的多能干细胞（iPSC）

2007年，Yamanaka 等用逆转录的方式（和逆转录因子Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc共培养）从体细胞诱导产生了多能干细胞。因为没有伦理学的问题，迅速成为干细胞治疗的新的细胞来源。iPSC可分化成包括心肌细胞在内的各种细胞系。Nelson等报道了用小鼠源性的iPSC治疗缺血性心脏病的小鼠使其心脏功能得以恢复。虽然iPSC已经显示了有益的促进心脏再生的结果，但其扩增效率及向心肌细胞的分化效率都很低，分化产生了包括非心肌细胞在内的各种类型细胞。另外，iPSC与ESC同样存在致畸胎瘤及移植后的免疫排斥反应等问题。iPSC目前还处于临床前研究阶段，其诱导方法也在进一步研究中。

3、重编程而来的心肌细胞

有趣的是，最近的研究证实可以通过三种心脏转录因子（Gata4, Mef2c, and Tbx5）从心脏和皮肤成纤维细胞直接编程产生心肌细胞样的细胞。另外，成纤维细胞可以通过病毒载体表达外源性的多能基因直接编码成心肌细胞（比如Oct4, Sox2, and Klf4），已有研究显示这些细胞移植可以减少小鼠的心肌梗死面积，改善心脏功能。但关于其临床应用的安全性仍存在争议。

4、骨髓源性的干细胞（BMSC）

多项研究证实BMSC移植可以有效地改善心脏功能。33项临床试验（入选1765例急性心肌梗死患者）的统计分析证实BMSC的移植可以改善左室射血分数。

内皮祖细胞（EPC）也是BMSC的一种，可以分化为内皮细胞。有关EPC治疗的研究显示其在改善损伤心脏的心功能方面能发挥有益作用，但其在移植后并不能分化为心肌细胞。这种心功能的改善可能与EPC促进血管新生、为宿主心肌细胞提供营养支持，以及通过旁分泌改善微环境有关。

5、间充质干细胞（MSC）

MSC因其来源广泛（包括骨髓，脂肪组织和脐血等）而颇具优势。MSC可以分化成心肌细胞，成骨骼肌细胞，软骨细胞和脂肪组织。由于MSC分化为心肌细胞的速率非常低，故体内治疗作用的主要机制被认为是其通过旁分泌作用分泌各种促进梗死区细胞存活、生长和分化的细胞因子。另外，MSC具有免疫耐受性。因为上述特点，MSC在干细胞为基础的异体移植方面具有重要地位。

6、成肌细胞

成肌细胞存在于肌肉的基底膜，可以再生肌肉组织。它们可以有效地对抗缺血，在体内可以分化成肌管。所以，成肌细胞被认为可以作为细胞疗法促进心肌再生。一些使用成肌细胞的研究也已证实可以改善左室功能。

尽管有一些有益的结果，但移植的成肌细胞并不能有效地分化为心肌细胞。另外，MAGIC试验报道移植到缺血性心脏病病人体内的成肌细胞会引起严重的副作用，如各种心律失常。

7、心脏原位干细胞

最近的研究发现，心脏本身也包含了不同的具有前体细胞的特性的未分化细胞。从心脏中分离出这些前体细胞并进行扩增，可以分化到不同的心脏细胞系，包括心肌细胞系。最近一项用自体c-Kit⁺的心脏原位祖细胞移植治疗缺血性心脏病的临床研究已经取得了令人鼓舞的结果。同时，激活原位心脏祖细胞分化潜能的策略也具有独到的优势，因其可以避免使用外源性干细胞所需要的繁琐的分离、纯化、扩增及再转染过程。

（1）干细胞抗原阳性（Sca-1⁺）的细胞

Sca是一种用来分离造血干细胞的细胞表面抗原。一些研究显示，Sca-1⁺的细胞可以在成体心脏中被分离出来，而在特定的培养条件下可以分化为搏动的心肌细胞。将Sca-1⁺的细胞移植到梗死周边区，可以分化成心肌细胞，并有报道其可以通过促进血管新生改善左室功能。

（2）c-kit⁺的细胞

c-kit+的心肌细胞在体外可以分化为心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞，移植到体内后可以促使心肌再生。从SCIPIO研究的结果看来，移植c-kit⁺细胞可以改善左室功能。但也有研究表明在成体心脏中c-kit⁺细胞缺乏促使心肌再生的能力。c-kit⁺细胞的来源不明，一项骨髓移植试验提示心脏中的许多c-kit⁺细胞是骨髓来源的。

（3）Islet (Isl)-1⁺的细胞

Isl-1在包括心脏在内的不同器官发育过程中具有重要作用。Laugwitz等分离出Isl-1⁺的心脏干细胞。一些研究提示缺乏Isl-1阻止了心脏的发育。最近的研究提示Isl-1⁺的细胞可以分化成乳鼠心脏中所有主要的细胞类型。

（4）心脏侧群（Cardiac Side Population，SP）细胞

SP细胞在不同的器官中存在，包括骨髓、骨骼肌、脂肪组织和心脏。SP细胞表达Sca-1并且可以分化为心肌细胞。在心脏损伤后SP细胞可以迁移到损伤区域来修复心脏功能。其分化机制有待阐明。

（5）心肌球细胞（Cardiosphere-Derived Cardiac Cells ，CDCs）

心脏干细胞在体外培养时可形成球样聚集，研究显示，CDCs可以改善心脏功能，但其缺点是与其他干细胞相比，形成心肌球需要花费相当的时间。另外，CDCs混有其他细胞类型 ，比如心脏成纤维细胞。

（6）心外膜源性的细胞（Epicardium-Derived Cells，EPDCs)

Limana等鉴定出人类和乳鼠的心外膜存在c-kit+/CD34+/CD45−的细胞类型，其可分化成心肌和血管细胞系。但EPDC的分化潜能仍然存在争议。

二、干细胞移植修复心肌存在的问题

干细胞疗法治疗心血管疾病存在的主要问题是移植后干细胞生存时间有限，故对干细胞进行修饰、改善移植微环境以使其更好地存活和发挥治疗作用可能是一种有前途的治疗策略。我们的研究小组转染整合素连接激酶（ILK）修饰的MSC治疗心肌梗死观察到其可以显著提高干细胞的归巢率、增强其生存能力、促进旁分泌作用，从而发挥更大的治疗作用。另外一个问题是由于移植的干细胞只有很小一部分可以真正分化为有功能的心肌细胞，故需要移植大量的干细胞, 国内葛均波领导的课题组采用了多次移植的方法取得了一定的疗效。另一个问题是干细胞的移植途径,目前常用的干细胞疗法采用冠脉内注射，但这些方法的细胞归巢率较低，而心肌内直接注射其安全性没有得到证实。另外，不同的研究采用的干细胞剂量也是相差迥异。基于先前的研究结果，不同的干细胞可以在心脏再生方面发挥有益的作用。然而，要使这些细胞真正用于临床治疗病人还有许多壁垒要攻克。不管怎样，发挥干细胞的所有优点，创造一种综合性治疗策略，可能会在心肌修复领域发挥更有效的作用。

MicroRNA（miRNA）诱导心脏再生

除了上述的干细胞疗法，最近的研究兴趣集中于基因及小分子为基础的治疗策略来增加内源性的心肌细胞增殖潜能。miRNA通过与靶mRNA的互补序列碱基配对调控转录后基因表达。研究显示，心肌细胞的miRNA通路受损会导致心力衰竭和心肌病。另外，许多miRNA表达谱的改变与不同的心脏病理过程相关。miRNA调控心脏再生的许多过程，包括心肌细胞增殖、分化、存活和重编程。2012年12月Nature杂志报道通过给予选择性的miRNA可以显著促进心肌细胞增殖和心脏修复。40种miRNA可以有效增加乳鼠心肌细胞的DNA合成和胞质分裂。进一步研究证实miR-590和miR-199a可以促进成体心肌细胞再次进入细胞循环，促进乳鼠和成体鼠的心肌细胞增殖。在小鼠心肌梗死后，这些miRNA可以显著促进心脏再生，并几乎使心脏功能完全恢复。

胞外基质（extracellular matrix，ECM）对于心脏再生的影响

研究发现细胞能感觉到外周环境，胞外基质对于心脏再生也具有重要影响。心脏胞外基质的基本成分是Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。I型胶原主要在健康心脏中表达，而Ⅲ型胶原在心脏受到损害时表达增多。在进展到心力衰竭过程中胞外基质广泛沉积，导致了心脏纤维化。在健康心脏中，ECM纤维沿着心肌细胞纵向排列，很少交叉。而在病理心脏中,ECM纤维的交叉排列显著增多，从而改变了ECM的机械属性。在心脏发育过程中，组织顺应性及细胞的形状和排列均发生了改变。除了影响心肌纤维的排列，ECM也可以影响新生心肌细胞核的排列。新生心肌细胞的成熟依赖于心肌纤维的有序排列，因为细胞骨架的合适排列才能具有合适的机械属性。而心肌细胞的搏动频率及收缩同步性均为组织强度依赖性的。当新生心肌细胞在相对僵硬的基质中培养时，培养几天后即停止搏动，且收缩不同步。当于强度相对正常的基质中培养时，这些细胞又可以获得其搏动频率及一致性。

ECM对于干细胞也会产生影响。Flk-1⁺心脏干细胞在层黏连蛋白包裹的三维支架上比在IV型胶原包裹的支架上能够更好地增殖。MSC在包裹有不同胶原亚型的胞外基质上培养显示，V型胶原促进心肌分化而I型和III型胶原则没有该作用。

   如前所述，ECM的顺应性在发育和疾病过程中发生了改变。非常软的基质有利于干细胞的神经源性分化，硬的基质有利于骨源性分化，而与肌肉僵硬度类似的基质则促进肌源性分化。体外实验提示梗死后心肌的胞外基质环境似乎有利于骨髓单核细胞向内皮细胞系的分化。而在小鼠梗死区注射MSC显示骨源性分化。另外，MSC的迁移也受基质强度的影响。如果将MSC在具有强度梯度的基质中培养，它们会向高强度处迁移。另外，细胞的肌源性分化与其在梯度中所处的位置有关。当然，组织强度不是唯一影响分化的因素。当分离的心脏单核细胞在具有不同孔径大小的三维基质中培养，心肌分化潜能也受影响。

值得提出的是，祖细胞-基质的影响并不是单向的。心脏祖细胞自身也可以合成胞外基质。所以，在病理性心脏中，祖细胞可直接或通过旁分泌作用影响胞外基质的属性。

展望

综上所述，目前促进心肌再生的研究策略可大体归纳为通过动员心脏干细胞或祖细胞，通过基因干预凋亡、自噬和坏死的信号通路，增加细胞的存活通路，促进已存在的心肌细胞再次进入细胞循环及改善细胞微环境来实现。一些因子，包括细胞因子以及细胞周期调控子，在胚胎期、出生后心脏的生长以及成体心脏损伤后的修复和再生方面均发挥了作用。最近的研究报道一些miRNA可以促进乳鼠和成体心肌细胞的分裂和增殖，调控参与心脏损害的miRNA如miR21,miR133, and miR29等，也可能成为有前途的治疗策略。但目前观察到通过基因调控干扰细胞信号通路的研究大多数情况是同时发生细胞凋亡，错误分化或者致死性心力衰竭。另外，正确地认识到DNA合成的激活和有丝分裂及胞质分裂的差异也是很重要的，因为仅仅有DNA的合成增加而缺乏后续的有丝分裂和胞质分裂过程并不能形成真正有功能的心肌细胞。经过十余年的研究，干细胞治疗、基因调控燃起了人们对于心脏再生的希望。关于合适的细胞类型，移植后细胞活力的保持，建立实用、安全的细胞转染技术，基因调控的位点、强度及时机等都在进一步研究中。不可否认，在心肌再生方面目前还面临着很多挑战，如获得合适亚型的干细胞；对于多能干细胞需要选取最佳的分化阶段并排除其致瘤性；使用自体细胞治疗所需要的扩增时间使得它们没有办法在急性期使用，而同种细胞移植则需要注意其免疫排斥反应；促进心肌修复的miRNA的筛选及干预时机尚待进一步研究等。          

总之，心脏再生医学领域方面仍有许多问题亟待解决，但我们相信，通过研究者在已有的研究成果基础上坚持不懈的努力，在心肌再生和修复方面必将迎来一个又一个令人振奋的结果，让我们拭目以待。