讲者：王长谦/上海交大医学院附属第九人民医院

血管内皮细胞是一层连续覆盖在血管腔表面的扁平鳞状细胞，为人体最大的内分泌旁分泌器官，可分泌十几种血管活性物质。许多血管活性物质的靶器官。在调节血管舒张状态、维持凝血和纤溶系统的平衡、抑制血小板聚集、抑制炎症细胞与内皮细胞间的粘附以及调控血管平滑肌生长等方面有重要的生理功能。血管内皮细胞分调节血管舒缩功能的因子：内皮素（ET）、血管紧张素（ANG）、前列腺素E2（PGE2）、前列腺素F2a（PGE2a）、血栓素A2（TXA2）；NO、前列腺素I2（内皮圆形舒张因子）。

内皮功能损伤是心血管事件发生的主要危险因子。正常情况下，血管内皮具有一定修复功能，机体内的细胞因子组成的抗炎系统和内皮祖细胞会修复损伤的内皮和血管，保护血管的完整性。然而，糖尿病、高血脂导致持续的氧化应激，耗竭了体内保护血管内皮抗炎系统，内皮细胞出现功能障碍、衰老，最后离开血管壁进入循环，进而引发了血管的损伤或导致局部血栓形成。

作为动脉粥样硬化、血栓等疾病的“罪魁祸首”，血管内皮功能损伤成为动脉粥样硬化发生的关键因素和始动环节。如果能恰当的评价血管内皮功能，就能很好地反映血管的功能，预测心血管事件的发生，尤其对早期高危人群筛选的无创检测具有意义。目前对血管内皮功能的评价有了一系列的研究。常用的检测手段包括以下几种：

（1）非侵入性血管检测。超声检测肱动脉血流介导的血管扩张功能( FMD）。这是目前最常用的方法，通过超声检测内皮依赖的血管舒缩功能来评估血管内皮功能，但受到标准不一、操作繁琐等的限制。正电子发射计算机断层显像（PET），相位对比磁振造影（Phase Contrast MRI）都是通过影像间接反应血管功能。（2）侵入性的血管检查，包括血管内超声、数字减影血管造影（DSA），因其具有创伤性且需要在心电导管室中完成而受到限制。（3）实验室检查。血管内皮细胞可合成并分泌多种生物活性因子（图1），故检测外周血液中内皮细胞释放的活性物质水平，如一氧化氮（NO）和内皮素-1（ET-1）可间接评价内皮功能。其他应用比较多的生物学指标有vWF、sTM、可溶性E- 选择素，sICAM和aVCAM-1、CEC、EPCs等。但是，它们是一个间接评价的指标，特异性受到限制，容易受到其他疾病导致的干扰，不够敏感。难以满足对心血管疾病的预测、预后评估、早期诊断、疾病严重程度分级等要求，寻求一种能特异、系统评价血管功能的指标一直是目前心血管研究的热点。当前生物标记物不足--不够特异、敏感；难以满足全部满足预测，早期诊断，疾病严重程度分级与预后评估等各方面的需求。

图1 内皮功能损伤血液标志物

内皮微粒及其对内皮功能损伤的评估

细胞微粒是细胞在活化、损伤或凋亡时从细胞表面脱落的直径0.1 to 1.0 μm的膜性小囊泡，它是一种亚细胞结构，其携带有许多母细胞的mRNA，miRNAs，受体和细胞特异性抗原。上世纪中叶就发现人类血浆和血清中存在一种促进纤维蛋白形成的亚细胞因子，直到1967年电子显微镜的发明，才证明这种亚细胞因子来源于血小板，将其描述为“血小板尘”（platelet dust）。随后的研究发现人类血液中含有各种各样的微粒，他们来自于不同的细胞（血细胞、平滑肌细胞等）。

内皮微粒的发现

1990年，Hamilton等奖补体蛋白C5b-9和钙离子载体A23187作用于脐静脉内皮细胞，第一次用流式细胞仪检测出一种直径小于1 μm的微粒，命名为血管内皮细胞微粒（EMP）。内皮细胞微粒（EMPs）是在炎症反应、缺氧等各种刺激因素作用下，血管内皮细胞释放出来直径小于1 μm的小囊泡，表达大量内皮细胞的表面蛋白，微粒内还包裹各种蛋白和RNA。不同细胞来源的微粒主要通过两种途径形成：细胞激活和凋亡。内皮细胞受多种激动剂作用而被激活，释放内皮微粒。目前研究比较常见的激活剂有LPS、IL-1、TNF-α、Thrombin、PAI-1、IL-6等细胞因子，还有C5b-9补体复合物和过氧化氢（ROS，氧化应激状态产生) 均能激活内皮细胞释放内皮微粒。内皮细胞在激活剂的介导下，依赖于Rho 因子相关激酶（ROCKⅠ ) 被活化，细胞骨架中肌动- 肌球蛋白收缩，细胞膜磷脂酰丝氨酸外化暴露于细胞膜, 以出芽方式形成小泡状结构而脱落，即内皮微粒。内皮微粒的蛋白成分多来源于母体细胞，但同时也有激活或凋亡过程中新出现的成分。

内皮微粒对内皮功能损伤的诊断价值

内皮微粒具有转运蛋白、RNA等信号分子的功能，在调节血栓形成、动脉粥样硬化发生、炎症反应、血管功能中发挥着重要作用。内皮微粒可以产生过氧化物，减少NO分泌，从而损伤血管收缩功能和内皮细胞活力。大量的内皮微粒可以促进内皮细胞的凋亡，抑制瓣膜内皮细胞的增殖和迁移；损伤内皮功能和血管形成；促进单核细胞向内皮细胞的粘附，加快动脉粥样硬化的进程；内皮微粒包含MMP-9 和MMP-2 等基质金属胶原酶，以旁分泌的形式促进细胞的侵袭；微粒上含有的（PAF-like phospholipids）活性磷脂激活中性粒细胞。来源于冠心病患者的内皮微粒能加速内皮损伤。

内皮微粒表达很多内皮特异性的法分子，如CD54、CD51、CD62E、CD31、CD105、CD144、CD146，凋亡诱导下的内皮微粒D31、CD105表达增加，促活化因子诱导下CD54、CD62E表达增加；促血栓形成状态下，内皮微粒表面的促凝血因子Active tissue factor（TF）/platelet factor 3表达增加。由于内皮微粒表面携带有大量内皮细胞的表面蛋白和生物信息，在不同的病理和生理情况下表达情况发生改变，是非侵袭性的监测内皮细胞功能的潜在标志。

EMP的测定方法

酶联免疫吸附法（ELISA）、流式细胞术（FCM）、电子显微镜和激光共聚焦显微镜都可以用来观察和检测内皮微粒。其中，流式细胞仪是检内皮微粒最常用方法。先离心取得血小板血浆，然后加入相应抗体，上机检测。由于血液中除了内皮微粒，还存在多种其他细胞来源的微粒，因此要使用具备较高特异性的抗体将内皮微粒与其他微粒区分开。常用标记物：CD51、CD31、CD144、CD146、CD105、CD54/ICAM-1、CD62E/E-selecrin、CD106、锚定蛋白V等。目前国际上最为常用的检测组合为CD31、CD42b，将EMP定义为CD32＋/CD42b-颗粒，但因CD31在血小板中亦丰富表达，其监测结果不够准确。由于内皮微粒比完整的细胞小得多，所带的表面蛋白也少得多，因而流式检测时也有一定的限制性，很难区分直径小于0.5 μm的EMP和细胞碎片。如果能富集内皮微粒就能更有效、敏感地检测各种表面蛋白。

流式微球技术检测内皮微粒

流式微球技术（CBA）集美联免疫吸附反应和流式细胞技术优点于一身的液相蛋白分析技术。利用包被有特异性的单克隆抗体的微球对一些小分子物质进行检测，利用微球的一种“放大”作用，可以准确地用流式细胞术对一些小分子物质进行检测。基本原理为：首先将捕获抗体包被在一定大小的微球上形成捕获微球，然后和待测样品溶液混合，微球上的特异性抗体就与样品（血清、血浆或细胞培养液）中相应的抗原或蛋白结合，再加入荧光标记的第二单克隆抗体，形成“三明治”夹心复合物，最后通过流式细胞仪进行检测。

新方法的特点

集美联免疫检测方法的高灵敏度、单克隆抗体的高特异性、流式细胞术的高通量和微球放大系统优点于一身，显著提高EMP检测敏感度。选用靶向与内皮细胞特异性膜标记物CD146的antiCD146制备捕获微球，提高了检测的特异性。循环中游离CD146分子亦可与捕获微球特异性结合，因此为防止游离CD146分子对检测结果的干扰，选用EMP的另一标记物CD31为检测靶标。体外试验结果表明，新的技术平台检测的内皮细胞微粒水平与另两个内皮细胞活化标志物（ET-1 和ICAM-1）及高敏C反应蛋白水平显著正相关，证明这一新的检测内皮细胞微粒的技术平台可用于检测内皮细胞的活化程度。

在上海市科委重点项目的支持下，已经建立了稳定、快速的流式微球技术检测内皮微粒方法，使用少量血液标本即可检测循环中内皮微粒的数量，相关文章发表在Circulation Journal 上，并申请发明专利一项。成功地把CD146单克隆抗体共价结合到羧基化微球表面，形成稳定的内皮细胞微粒捕获微球，并利用流式微球技术和FITC-anti-CD31抗体检测细胞培养上清液或外周血中内皮细胞微粒的水平，首次建立了稳定的流式微球技术检测内皮细胞微粒技术平台。因CD31在血小板中亦丰富表达，其检测结果不够准确。所以我们选用靶向于内皮细胞特异性膜标记物CD146的antiCD146 制备捕获微球，提高了检测的特异性。循环中游离CD146分子亦可与捕获微球特异性结合，为防止游离CD146分子对检测结果的干扰，我们选用EMP 的另一标记物CD31为检测靶标。这样既增加了内皮微粒检测的敏感性，又提高了特异性，使得实验结果更为准确。

入选健康对照80例，非冠心病的匹配患者94例，稳定性心绞痛111例，急性冠脉综合症145患者例。研究发现，在急性冠脉综合征患者较稳定型心绞痛患者的外周血中内皮细胞微粒水平表达更高，反映了急性冠脉综合征患者内皮细胞具有更高的活化/ 受损程度。进一步临床试验数据发现，有高血压、高血脂、糖尿病和吸烟史的患者内皮微粒表达水平明显增加。将胸痛患者按内皮微粒水平分为四组（<660；660~820；820~980；>980），发现内皮微粒水平最高组（>980）的患者，临床终点事件发生率最高。随访中，急性冠脉综合征患者发生23个临床终点事件，稳定性心绞痛发生6个终点事件，急性冠脉综合征终点事件发生与其内皮微粒水平正相关，对比年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病、体重指数、ET-1、ICAM-1、内皮微粒等危险因素，年龄、糖尿病、 ET-1和内皮微粒可以作为胸痛患者临床事件的独立预测因子。

由此可见，内皮微粒内不仅对皮功能检查有重要临床价值，而且对冠心病的诊断和危险分层具有一定价值。尽管血清内皮功能损伤标志物有众多研究，但内皮微粒仍是具有临床应用潜力的生物标志物。

来源：医心网

编辑：Yvonna