目的利用高胆固醇饮食(2%)并免疫损伤诱发的主动脉粥样硬化模型，评价阿司匹林(aspirin, ASA)抑制动脉粥样硬化炎症反应、斑块进展及内膜增生的作用。
方法将40只建立起主动脉粥样硬化模型的新西兰大白兔随机分为ASA小(4 mg/(kg×d))、中(12 mg/(kg×d))、大 (20 mg/(kg×d))剂量和高胆固醇4组，另设对照组，每组各10只。测定指标包括0、2、12周时的血脂、12周时的血清C反应蛋白(CRP)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、主动脉斑块/内膜面积比、斑块脂质含量、内、中膜厚度和内/中膜厚度比以及斑块部位平滑肌细胞和巨噬细胞的阳性率。
结果ASA小、中、大剂量组与高胆固醇组相比，主动脉斑块/内膜面积比分别减少20.86%、43.85%和42.80%，斑块脂质含量分别减少28.83%、34.95%和48.57%，内膜厚度分别减少57.7%、71.2%和71.3%，内/中膜厚度比分别减少49.03%、67.10%和69.03%，(P<0.01~0.05)；斑块部位平滑肌细胞阳性率减少17.6%、39.4%和57.2%；巨噬细胞阳性率分别减少35.7%、50.7%和64.7%，均有非常显著性差异(P均<0.01)；CRP和MCP-1也显著降低(P均<0.01)。ASA大、中、小剂量组间比较，主动脉斑块/内膜面积比、斑块脂质含量、内膜厚度、内/中膜厚度比、CRP和MCP-1在大、中剂量组显著低于小剂量组(P<0.01~0.05)，而大、中剂量组间无显著差异(P>0.05)；斑块部位平滑肌细胞和巨噬细胞的阳性率在中剂量组显著低于小剂量组，在大剂量组又显著低于中剂量组(P均<0.05)。
结论阿司匹林能剂量相关地抑制动脉粥样硬化的炎症反应、斑块进展及内膜增生。
关键词动脉粥样硬化 阿司匹林 炎症反应

The effects of aspirin on inhibiting the inflammation and progression of the atherosclerosis and the noeintimal proliferation
Tang Yida, Chen Jilin, Ruan Yingmao, et al.
Division of Coronary Heart Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing(100037)
    Abstract
    Objective To evaluate the effects of aspirin on the inflammation and progression of aortic atherosclerosis and the neointimal proliferation.
    Methods Fourty New Zealand White rabbits fed on a 2% cholesterol diet and 10% Albumin Bovine V injection were administered aspirin at 4 mg/(kg·d)(Ld-ASA), 12 mg/(kg·d)(Md-ASA), 20 mg/(kg·d)(Hd-ASA) or distilled water(H-cho)for 12 weeks，Normal-diet rabbits were selected as control, 10 rabbits in each group. The detected parameters included serum lipids, C-reactive protein(CRP)and Monocyte Chemoattactant Protein-1 (MCP-1), the thickness of intima and medium, intima/medium thickness ratio, lesion/intima size ratio and the lipid content of plaque and the positive percentage of smooth muscle cells and macrophage cells in the plaque(PPSMC and PPM?).
    Results Compared with H-cho group, rabbits in Ld-, Md-and Hd-ASA groups showed dose-dependant reduction of lesion/intima size ratio in 20.86%, 43.85% and 42.80%; lipid content of plaque in 29.83%, 34.95% and 48.57%; the thickness of intima in 57.7%, 71.2% and 71.3%; intima/medium thickness ratio in 49.03%, 67.10% and 69.03%; the positive percentage of smooth muscle cells in 17.6%, 39.4% and 57.2%; the positive percentage of macrophage cells in 35.7%, 50.7% and 64.7%; respectively (p<0.05-0.01). CRP and MCP-1 decreased also in three therapy groups (all p<0.01). lesion/intima size ratio, the lipid content of plaque, the thickness of intima, intima/medium thickness ratio, CRP and MCP-1 reduced more in Hd-and Md-ASA group than in Ld-ASA group(p <0.05-0.01), but no differences between Hd-and Md-ASA groups(p>0.05). the positive percentage of smooth muscle cells and macrophage cells reduced more in Hd-and Md-ASA groups than in Ld-ASA group(all p<0.01), and the same as in Hd-ASA group than in Md-ASA group(p<0.01).
    Conclusion Aspirin can dose-dependantly inhibit the inflammation and progression of the atherosclerosis and the neointimal proliferation.
    key words Atherosclerosis; Aspirin; Inflammation

    阿司匹林(Acetylsalicylic acid tablets，ASA)可通过抗血小板作用减少冠心病患者心脏事件的发生率，但其作为一种非甾体类抗炎药，能否抑制动脉粥样硬化 (Atherosclerosis, AS)炎症反应来抑制斑块进展和内膜增生，尚无定论。因此，本研究利用高胆固醇饮食并免疫损伤法建立兔主动脉AS模型，观察ASA能否抑制AS的炎症反应、斑块进展和内膜增生。
    1 材料与方法
   动物模型与分组治疗 自2001年8月至2002年8月，对50只体重2.0~2.5 kg的雄性新西兰大白兔，随机抽取40只建立AS模型：以2%高胆固醇饲料每只每日100g喂养，待血脂显著升高后按250 mg/kg给予10%牛血清白蛋白静脉注射，隔4日1次，共3次；模型兔随机分成ASA小[4 mg/(kg·d)]、中[12 mg/(kg·d)]、大[20 mg/(kg·d)]剂量和高胆固醇组四组。另选正常饲料喂食者作对照，每组各10只。给药：将ASA(100mg/片，无锡阿斯特拉公司生产，批号：51-041-2076)用蒸馏水配成浓度为0.5g/dl，1.5g/dl和2.5g/dl的药液，于喂养高胆固醇饲料同时开始直接灌胃给药，ASA大、中、小剂量组每日每只2ml，每日1次，另两组灌等量蒸馏水。
    血脂、C反应蛋白(CRP)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的测定 0、2和12周时分别采静脉血利用酶学方法测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，并利用公式"低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) (mg/dl)=TC-(HDL-C)-0.2TG"计算出LDL-C。另于动物处死前采静脉血利用固相酶联免疫吸附实验(ELISA)方法(兔CRP和MCP-1的ELISA检测试剂盒均购自美国LIFEKEY公司)分别检测其血清CRP和MCP-1水平。
    标本取材及AS炎症、斑块进展和内膜增生指标的测定 氯胺酮35 mg/kg并安定5 mg/kg腹腔注射麻醉兔，剖开胸腹腔，游离主动脉全长并剥离外膜脂肪组织，纵行剖开后置10%多聚甲醛中保存。大体标本行苏丹III染色后用"天地病理、细胞图像分析系统(version 1.0)"测定斑块大体面积和内膜总面积并计算主动脉斑块/内膜面积比；然后将主动脉全长均分为5段，每段分别制成4 mm厚的横截面病理切片行 HE和弹力纤维染色，利用相同的图像分析软件测定斑块内、中膜厚度和LCP并计算斑块脂质含量，最后将5段标本的相应指标加以平均，作为主动脉截面标本各指标的测定值[1]，另取4 mm厚横截面病理切片用抗兔平滑肌细胞特异性单克隆抗体a-actin(购自美国Sigma公司)和抗兔巨噬细胞特异性单克隆抗体RAM11(购自美国DAKO公司)行免疫组织化学染色。
    统计学方法 以SPSS 10.0软件包建立数据库进行统计分析，所有指标用均数±标准差表示，多组间比较用方差分析，两组间比较用q检验，P<0.05表示差异有显著性。
    2 结 果
    去除实验过程中死亡者，最终在ASA小、中、大剂量、高胆固醇和对照组分别存留有8，8，8，8和9只动物。
ASA不影响血脂水平：所有实验兔入选时(0周)各项血脂指标均无差异；4组高胆固醇饮食兔在喂养2周、12周时的TC和LDL-C均显著高于对照组(P均<0.01)且12周时的TG也显著升高(P<0.01)，但每时间段4组间均无显著性差异(P均>0.05) 。 表1、阿司匹林(ASA)对血脂的影响（mg/dl，x±s）：

组别	例数	TG	TC	HDL-C	LDL-C
对照组	9
0周	0	81.59±19.45	44.89±15.79	12.96±2.70	15.62±14.2
2周	0	89.10±33.07	52.71±18.42	14.09±3.49	20.80±15.46
12周	0	62.83±22.32	50.52±15.77	21.47±4.61	16.49±12.34
高胆固醇组	8
0周	0	80.53±24.49	44.89±15.79	15.20±5.58	19.51±12.37
2周	0	130.81±123.15	555.24±382.10*	18.73±10.36	510.35±385.18*
12周	0	385.49±239.92△	1132.31±27.62△	27.95±10.79	1027.27±59.65△
小剂量ASA组	8
0周	0	75.69±17.55	48.58±13.66	13.33±4.21	20.11±16.06
2周	0	121.08±81.70	581.54±304.60*	15.55±5.17	541.77±306.20*
12周	0	394.53±229.17△	1123.20±11.11△	24.50±9.41	1019.80±53.23△
中剂量ASA组	8
0周	0	78.20±13.49	47.11±11.17	12.55±3.67	18.92±10.20
2周	0	101.50±54.83	618.51±448.80*	17.30±4.28	580.91±454.19*
12周	0	284.85±98.41△	1121.29±17.69△	24.13±7.91	1030.19±31.96△
大剂量ASA组	8
0周	0	79.16±20.90	50.81±11.14	12.28±2.72	19.48±14.41
2周	0	111.55±75.14	603.29±410.79*	17.30±4.28	562.68±416.20*
12周	0	326.78±135.76△	1121.10±17.41△	27.50±12.90	1019.80±53.23△

注：2周时，与对照组相比，* P<0.01；12周时，与对照组相比，△P<0.01；TG：甘油三酯, 1mg/dl=88.5′mmol/L；TC：总胆固醇, 1mg/dl=38.61′mmol/L；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇, 1mg/dl=38.66′mmol/L；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇, 1mg/dl=38.66′mmol/L；
    ASA对AS炎症、斑块进展和内膜增生的影响：CRP、MCP-1、主动脉斑块/内膜面积比、斑块脂质含量、内/中膜厚度比以及斑块部位平滑肌细胞和巨噬细胞的阳性率在ASA大、中、小3剂量组均显著低于高胆固醇组(p<0.01~0.05)，但均高于对照组(p >0.05)；ASA大、中、小3剂量组间比较，主动脉斑块/内膜面积比、斑块脂质含量、内/中膜厚度比、CRP和MCP-1在大、中剂量组显著低于小剂量组，均有非常显著性差异(p均<0.05)，而在大、中剂量组间无显著性差异(p >0.05)；斑块部位平滑肌细胞和巨噬细胞的阳性率在大、中剂量组显著低于小剂量组，在大剂量组显著低于中剂量组，均有非常显著性差异(p均<0.01)。
表2、阿司匹林(ASA)对斑块进展、内膜增生和炎症反应的影响（x±s）

0	例数	斑块/内膜面积比值	斑块脂质含量(%)	CRP(ng/ml)	MCP-1(pg/ml)	内膜厚度(mm)	内/中膜厚度比	平滑肌细胞阳性率	巨噬细胞阳性率
对照组	9	0	0	188.38±44.31	131.65±12.57	0	0	0	0
高胆固醇组	8	95.4±5.8**	70.75±12.92**	582.06±109.77**	420.36±85.49**	342.65±54.53**	1.55±0.36**	59.6±5.6**	52.1±3.2**
小剂量ASA组	8	75.5±20.4**△	50.35±12.61**△△	364.33±90.41**△	337.09±76.52**△	144.93±80.95**△△	0.79±0.39**△△	49.1±2.5**△△	33.5±2.2**△△
中剂量ASA组	8	53.5±19.5**△△ ▲	46.02±10.02**△△	316.39±63.72**△	330.53±44.95**△	98.78±41.63**△△▲	0.51±0.22**△△▲	36.1±3.1**△△▲▲	25.7±2.2**△△▲▲
大剂量ASA组	8	54.6±23.3**△△ ▲	36.39±6.81**△△▲▲	282.18±42.48*△▲	272.90±17.12**△▲	98.42±18.24**△△▲	0.48±0.09**△△▲	25.5±1.1**△△▲▲ §	18.4±2.5**△△▲▲ §

注：与正常对照组相比，* P<0.05，** P<0.01；与高胆固醇组相比，△ P<0.05，△△P<0.01；
与小剂量ASA组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与小剂量ASA组相比，§ P<0.01；

    3 讨 论
        AS是一种炎症-增生性疾病，巨噬细胞黏附至损伤内皮并吞噬脂质和平滑肌细胞的迁移、增殖这些炎症过程与斑块的形成、进展及再狭窄密切相关[2,3]，因此抑制巨噬细胞黏附和平滑肌细胞增生的炎症过程有可能能抑制AS进展并有助于预防再狭窄。ASA兼有抗血小板和抗炎的双重效应，有研究报道ASA有抑制高脂饮食诱发的小鼠AS进展[4]和炎症诱发的细胞增生[5]的作用，但对AS斑块局部的炎症反应、斑块进展和内膜增生的作用尚不清楚。本研究观察了小、中、大剂量ASA(分别相当于100mg/d、300mg/d和500mg/d的临床剂量)对斑块进展和内膜增生的影响，结果显示它能剂量相关地抑制斑块进展，小、中、大剂量分别使斑块面积减小20.86%、43.85%和42.80%；并显著抑制内膜增生，使内膜增生减少49.03%、67.10%和69.03%。本研究显示各项血脂指标不受ASA的影响，而CRP和MCP-1显著降低，且与ASA剂量正相关，提示ASA抑制斑块进展和内膜增生的机制与调节血脂无关，可能与其抗炎作用有关：炎症反应主要通过环氧化酶-2(COX-2)途径促进AS斑块进展，而ASA正是通过COX-2途径产生抗炎作用，因此能抑制AS斑块进展和细胞增殖[5,6]。
        巨噬细胞在AS的形成和发展过程中起重要作用，是泡沫细胞的主要来源和斑块脂质核心的主要组成部分，它还能分泌蛋白水解酶弱化斑块纤维帽导致斑块的不稳定并分泌组织因子诱发血栓[2,3]。本研究发现小、中、大剂量ASA分别使斑块巨噬细胞阳性率减少35.7%、50.7%和64.7%，与Cyrus等[7]报道的小剂量ASA可使AS局部的巨噬细胞数量减少57%的结果一致。
        平滑肌细胞增生也是AS形成和发展的重要环节，最初胆固醇沉积吸引平滑肌细胞从中膜向内膜迁移并逐渐增生，而巨噬细胞也能释放一些促平滑肌细胞迁移、增生的因子，在两因素双重作用下，平滑肌细胞不断迁移、增生，主要形成斑块组织的纤维帽[2]，本研究结果也证实平滑肌细胞阳性细胞主要分布于斑块组织近内膜面；平滑肌细胞增殖同时还是再狭窄过程中最重要的病理过程之一，经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)及支架可引起血管局部炎症反应，吸引炎性细胞浸润并主要促进平滑肌细胞迁移和增生，导致血管再狭窄[8]。本研究显示，小、中、大剂量ASA分别使内膜厚度减少57.7%、71.2%和71.3%，平滑肌细胞阳性率减少17.6%、39.4%和57.2%，提示ASA减轻内膜增生的作用主要源于其对平滑肌细胞迁移和增生的抑制，这与Voisard等[5]报道中剂量ASA能抑制炎症诱发的平滑肌细胞增殖达83%的结果类似。ASA抑制平滑肌细胞增生的可能机制有如下几点，① 通过对巨噬细胞的抑制作用减轻其促平滑肌细胞增生的作用[8]；② COX-2存在于AS部位的单核/巨噬细胞系统和平滑肌细胞上，而平滑肌细胞上的COX-2途径是其增生的作用途径，ASA可通过对SMC的COX-2途径直接对其增生进行抑制[6]。
       总之，ASA可抑制斑块进展和内膜增生，其机制与抑制AS斑块局部的炎症反应，使巨噬细胞黏附减少，SMC迁移、增生减少有关。

来源： 医心网