大连医科大学附属第一医院  黄榕翀
复旦大学附属中山医院  葛均波

　　CIT 2008会议期间，主办方专门设置了“心血管疾病细胞水平介入治疗”一节，针对目前心血管疾病研究领域中干细胞移植的热门话题展开了相关讨论。

　　目前，包括胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞及骨骼肌干细胞等细胞移植的许多动物实验及临床实验都证实了干细胞移植可以改善心脏功能，但其具体机制仍然不清楚。通常认为干细胞移植可以增加细胞因子如VEGF的释放，促进缺血区域新生血管的形成，改善灌注、改善冬眠心肌和顿抑心肌功能，减少心室扩张及心室重构。移植的干细胞在局部微环境的诱导下可以分化为心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等，即具有可塑性，但是也有研究发现移植的骨髓干细胞并没有分化为心肌细胞，只是分化为不同的血液细胞。近年来，我国阜外心血管病医院杨跃进教授领导的研究小组在干细胞基础研究领域方面取得了一系列进展。其体外研究发现，MSCs10代后细胞分化减速，在体细胞标记后研究显示MSCs移植确实在梗死区局部发现新生的分化心肌细胞，而其结果也被祁春梅等研究人员证实。尽管关于干细胞移植与分化机制的基础研究尚未取得一致的结果，但是从2002年到2008年间大多数前瞻性随机对照研究、队列研究以及病例报告均认为干细胞移植有助于改善急性心肌梗死、陈旧性心肌梗死及心肌梗死后心衰临床症状与心脏功能，极有可能成为冠心病治疗的辅助手段之一。尽管如此，干细胞移植中存在的诸多尚未解决的问题仍是今后需要着重研究的方向。

　　首先是安全性问题，这也是干细胞移植的基本问题。尽管早期研究发现骨骼肌成肌细胞移植可能导致恶性心律失常增加，间质细胞移植可能引起钙化，而G-CSF动员可能增加支架内再狭窄率增加等等，但新近的大多研究并没有发现与干细胞移植相关的不良心脏事件、再狭窄率及再血管化率增加等，甚至有些研究发现与对照组相比，干细胞移植组总体不良事件减少。但如干细胞移植能否增加肿瘤的发生，能否加速动脉粥样硬化的形成等其他问题尚有待评估。

　　其次是干细胞移植的有效性问题，是否依赖于细胞数量、移植的时间、现有常用的经冠脉移植途径或者经心外膜注射途径是否有效、移植后细胞能生存多久、细胞移植对于心脏功能的改善幅度多大等等问题仍然没有一致的意见。

　　2002年TOPCARE-AMI试验将20名成功接受PCI术的AMI患者随机分成两组，其中11名患者移植外周血循环来源的祖细胞，9名患者移植骨髓单个核细胞，随访4个月，发现治疗组LVEF显著改善, 18F-FDG-PET结果显示治疗组患者梗死区心肌存活率上升，而非梗死区无明显改变。1年后随访结果显示，细胞移植对于心脏功能的改善可以维持较长一段时间，与对照组相比，接受细胞移植的患者1年后LVEF改善幅度仍然高于对照组。2004年的Boost实验为一项随机对照临床实验，Wollert等采用骨髓源干细胞，在PTCA同时对30位心肌梗死小于5d的患者进行细胞移植，随访6个月，结果显示LVEF增加。与TOPCARE-AMI 1年随访结果不同，该研究18个月随访结果发现收缩功能未见进一步改善，但干细胞移植可以持续改善患者舒张功能和临床症状。2003年开始的TCT-SATMI研究由我国复旦大学中山医院葛均波教授组织完成的，该项目是单中心、前瞻性、随机、对照研究，主要应用多种影像学方法评价骨髓干细胞移植后左室功能、左室梗死面积等变化及安全性。从2003年4月入选第一例患者，该研究前后进行了大约3年时间，共有271名首次ST段抬高性急性心肌梗死患者入选本项研究，随机分为自体骨髓干细胞移植组或者对照组。所有患者均在成功接受PCI术后3小时内接受细胞移植或者生理盐水注射。12个月随访结果证实急诊经冠脉内细胞移植方法安全可行，12个月时LVEF明显提高，LVEF增加幅度约8％，同时心肌梗死面积明显缩小，左室重构减低、心肌灌注缺损面积也明显缩小，初步证实急诊经导管骨髓单个核细胞移植可以改善急性心肌梗死后左室功能，阻止心室重构。2006年报告的REPAIR-AMI为第一项双盲、大规模、随机多中心对照研究，结果显示，与对照组相比，移植后4个月时细胞移植组患者LVEF明显增加（5.5±7.3% 比 3.0±6.5%，P=0.01），LVESV减少，同时心肌梗死面积减少，但是两组间LVEDV没有明显差别；移植后1年不仅左室功能改善，还可以降低包括死亡、再发心肌梗死和再次血管化治疗的比率，改善临床症状，提示细胞移植有助于改善心脏功能。REPAIR-AMI亚组分析显示，移植疗效与基础LVEF及移植时间有关，LVEF低于49％的患者和移植时间大于PCI术后5天的患者受益更多。比利时S. Janssens等的随机双盲对照研究结果，32名急性心梗后24小时内接受未分选骨髓干细胞患者与34名抽取骨髓但未回输患者比较，MRI显示细胞移植与梗死区收缩幅度增加有关，提示损伤心肌修复增强可能是此现象发生的机制之一，但是两组患者LVEF没有明显差别。挪威学者Lunde等入选97名急性心肌梗死患者，随机分为骨髓单个核细胞移植组（n=47）和对照组（n=50），平均于心肌梗死后6天进行细胞移植，观察移植后LVEF变化。移植后6个月，SPECT数据显示单纯PCI组患者和细胞移植组患者LVEF均增加7％以上，但是两组间没有显著差别。同时，MRI结果发现两组间LVEF变化值、LVEDV以及梗死面积的变化值之间均没有统计学差别。ASTAMI研究和上述研究不同，其结果显示细胞移植组与对照组心脏收缩功能未见明显差别，随后的专家述评指出此研究使用的细胞分离和保存方法、细胞数量偏少可能是研究结果不同的原因。2006－2007年先后三个比较全面评价细胞移植治疗心血管疾病的荟萃分析结果先后发表，其中也包括南京第一人民医院陈绍良教授和辽宁省人民医院李占全教授等几个小组的研究结果及前面提及的部分研究，分析结果提示与对照组相比，干细胞移植不增加患者MACE、支架内再狭窄、TLR、TVR、再住院率以及肿瘤等不良事件发生率，且可以显著提高患者的整体和局部心脏功能。

　　这些试验大多数属于Ⅰ期临床试验，主要评价干细胞移植治疗冠心病的效果及可行性。虽然众多试验均表明骨髓干细胞移植后心脏功能有所改善，而且细胞移植并不增加负性临床事件，包括致心律失常和支架内再狭窄等。但与急性心肌梗死研究一样，由于同时有血管重建等混淆因素参与，其结果的说服力被削弱。

　　有关细胞移植时间的问题目前也是争论的热点之一。移植时机的选择直接影响到移植干细胞的存活。移植过早可能由于局部微环境恶劣致使大量移植的细胞死亡，影响移植效果。移植过晚则可能局部损伤已不可逆，心室重构已形成。因此合适的移植时机至关重要。

　　多个关于最佳移植时间确定的动物研究结果不同。Reinecke等研究认为在损伤区形成一定毛细血管且炎症反应逐渐消退时进行移植较为合适。Soeki发现在心梗后第7 天，促使血管再生的血管内皮生长因子(vEGF) 的分泌达到高峰，这将有利于提高移植细胞的存活率。在心梗发生后2周，由于疤痕的形成似乎也不利于细胞移植。基于上述原因，Bodo推测骨髓干细胞移植的最佳时机是7～14 d。Frangogiannis等也认为心肌梗死后早期炎症因子释放导致细胞存活率低，因此心肌梗死后2周移植效果比较好。但Silesian医学院的Wojakwoski等分析了56例ST段抬高型急性心肌梗死患者发病后24小时、4天和7天时干细胞动员情况。他们发现在心肌梗死早期，能明显动员循环血中组织干细胞，包括CD34+细胞、CXCR4+细胞和CD117+细胞，以梗死后24小时最显著，提示此时进行干细胞移植，自身动员的干细胞将协同外来的干细胞一起参与梗死心肌的修复。我们研究发现心肌梗死后24小时SDF－1分泌达到高峰，有助于移植的细胞迁移到梗死边缘区，心肌梗死后4天SDF－1分泌则减少，因此认为心肌梗死后24小时是理想移植时间。我们的临床实验也证实，在20例经冠脉内移植自体BM-MNC治疗24小时以内的急性心肌梗死患者的随机化临床研究，随访6月发现心肌梗死超急性期（24小时内）进行骨髓干细胞移植能明显改善缺血心脏功能和左室灌注。同样，澳大利亚的Vienna医院的Beran等对10例ST段抬高型急性心肌梗死8周患者，进行冠脉内移植联合心内膜下注射BM-MNC,随访3月、6月，发现LVEF提高并不显著。这些结果表明在急性心肌梗死急性期进行的干细胞移植可能较梗死后期更有利于心脏恢复。然而，目前临床研究中尚没有以不同移植时间与移植疗效的关系作为研究终点的研究，REPRIR-AMI亚组分析也仅限于心肌梗死后3～7天的区间观察得到上述结论，而Lunde进行相似的细胞移植后，并没有发现6天移植比单纯PCI组有更好的治疗效果，我们和其他小组的研究发现心肌梗死后24小时内或者2周移植同样有效，有趣的是，Lunde等的研究入选患者的LVEF基线水平在41～42％，与REPRIR-AMI亚组分析中LVEF低于49％的患者相比，细胞移植后LVEF改善幅度均在7％左右。问题是两个研究中对照组患者LVEF改善幅度相差很大（3％ 比 7％），有限的临床数据显示两项研究中对照组基线LVEF不同（42％ 比 47％），接受再次PCI比例大致相当（10/101 比6/50），但病变程度及范围无法比较，而PCI术改善程度又与患者LVEF基线水平、病变累积血管数量、病变狭窄程度、并发症、病变时间等因素有关，因此两组研究中单纯PCI组患者LVEF改善程度可能相差很大；还需要指出的是，目前临床研究中多数以左室功能作为研究终点，而左室功能评价手段不同（磁共振扫描、SPECT、心脏超声以及左室造影等）且缺乏统一的评价标准，各个研究间的数据很难进行比较，同时，基线LVEF评价的时间不同，从心肌梗死后3天－几周不等，一般来说，心肌梗死后1个月经过炎症反应期、心肌修复期以及瘢痕形成期等，期间LVEF变化幅度很大，基线LVEF确立时间如此大的时间跨度，无疑会影响最终LVEF变化值的评价。因此，如何界定最佳移植时间的选择区间，是否适用于所有的心肌梗死患者还需要进一步研究。

　　此外，动物试验发现移植细胞的数量与心脏功能改善在一定范围内呈线性关系，即细胞数量越多，移植效果越好，而且，采用经冠脉注入的移植方法，细胞到达梗死区域的比例在3％～5％。然而在临床研究中并没有发现这种关系，不同研究中细胞移植数量差别数千倍（106～109），但是左室功能改善幅度似乎与细胞数量无关，LVEF提高幅度从1％～10％，部分研究甚至应用细胞数量较多得到阴性结果。多数研究采用单个核细胞或者间质细胞，不同个体CD34＋等可能有效的细胞比例相差也很大，因此，能够真正到达并在梗死心肌区域存留的、有助于修复损伤心肌的干细胞绝对数量不多且无法比较，这是否也与动物研究中梗死心肌面积比较广泛，基线LVEF低，而多数临床研究中入选患者基线LVEF在50％左右，即患者心脏功能比较好，梗死心肌面积不够广泛，尚不足以体现出不同细胞数量级间移植疗效的差别有关。REPAIR－AMI亚组分析结果已经提示心脏功能差或者说心肌梗死面积广泛的患者会受益更多，高连如教授进行的研究也发现对于严重缺血性心脏病患者行干细胞移植可以显著改善患者左室功能和临床症状，但是对于心脏收缩功能严重低下的患者细胞移植是否安全可行目前尚缺乏大规模循证医学证据，因此今后的临床研究中需要入选LVEF低下的患者，观察不同移植细胞数量间移植疗效的差别，我们才能得出最后的结论。

　　目前对干细胞移植的远期疗效定论还为时尚早，临床研究结果还需要在动物实验尤其是大动物实验中加以证实。尽管小动物实验具有成本低、顺从性好、大批量进行的优点，但是它们不能完全再现人心血管生理的各个方面。比如，小鼠及大鼠的基础心率很快，细胞移植后很难发现快速心律失常的发生情况，而同样细胞移植到狗、猪或者羊心脏后，就可能发现致心律失常的并发症。重复性好的可以较好模拟临床疾病的动物模型也是目前研究的热点，应用此类模型有助于我们更深入、更细致地探讨干细胞移植治疗心血管疾病的可行性，在进行更广泛临床研究之前，我们仍旧需要在动物模型上进行审慎的研究。